不同消毒劑對禽舍細菌氣（qì）溶膠（jiāo）多樣性的影響

        為了更好地了解不同消毒劑對肉雞舍微生物種類和數量的影響，使用了臭氧、有效氯、季（jì）銨鹽、戊二醛和混合消毒劑等五種不同類型的消毒劑。通過高通量測序結（jié）合空氣采樣分析（xī）肉雞舍微生物群落（luò）。結果表明，與未使用消毒劑的雞舍相（xiàng）比，施用不同消（xiāo）毒劑的空雞（jī）舍空氣中需氧菌濃度顯著降低（P < 0.05或P< 0.01), 消毒後可吸入空氣中需氧菌顆粒數急劇下降。在五種消毒劑中，混合消毒劑對總（zǒng）微生物群落的消毒效果很好（P < 0.05）。高通量測序共獲得508143個高質量序列，確定了1995個（gè）可操作的（de）分類單元。總共（gòng）鑒定出 42 個門和 312 個屬（shǔ）。施用不同消毒劑後肉雞舍內空氣中微生物（wù）群落結構不同。在混合消毒劑（jì）處理的房屋中，微生物群落中含有機會致病菌，如大腸杆菌、誌賀氏杆菌、芽孢（bāo）杆菌和假單胞（bāo）菌，豐度很低，與未經消毒劑處（chù）理（lǐ）的房屋相比，豐度顯著降低。α多樣性指數顯示，混合消毒劑處理的雞舍內（nèi）微生物群落多（duō）樣性較低。與其他四種消毒劑相比，混合消毒劑處理（lǐ）過的（de）房（fáng）屋的空氣樣本中僅檢測到少量（liàng）細菌；具體來說，隻發現了四個（gè）門（變形菌門、擬杆菌門（mén）、放線菌門和厚（hòu）壁菌門）。混合消毒劑對（duì）四個門類的消毒產生了積極（jí）的影響（xiǎng）；但是，它並（bìng）沒有徹底消除它們。在屬水平上，芽孢杆（gǎn）菌屬、Arenimonas和Shinella用混合消毒劑處理過的雞舍檢測不到，用其他消毒劑處理過的雞舍檢測到。高通量測序結（jié）果表明，多種消毒劑聯合（hé）使用具有良好的消毒（dú）效果，該技術可以對肉雞舍的空氣進行消毒。這些結果將有助（zhù）於指導製（zhì）定（dìng）合理的肉雞舍消毒方案。

介紹

近（jìn）年（nián）來，隨著畜牧業（yè）和養殖業（yè）集約化程度的不斷提（tí）高，圈養動物（wù）的密度不斷增加。此外，動物傳染病（bìng）的傳播正（zhèng）在加速，各種動物流行病已經（jīng）出現（Wu et al., 2012 ; Mellata, 2013 ; Mughini-Gras et al., 2014 ; Threlfall et al., 2014 ; Barbosa et al. ，2017 年；Poulsen 等人，2017 年；Stromberg 等人，2017 年；Vinayananda 等人，2017 年）。因（yīn）此，畜（chù）禽（qín）舍（shě）的消毒已成為防治疾（jí）病的重要措施。肉雞舍常用的化學消毒劑包括有效氯、臭（chòu）氧、季銨鹽和戊二醛（Meroz 和 Samberg，1995 年；Saklou 等人，2016 年；Chidambaranathan 和 Balasubramanium，2017 年）。用於（yú）肉（ròu）雞舍大規模消毒的不同消（xiāo）毒劑作用機製不同，因此其消毒效果（guǒ）也不同（Suwa et al., 2013 ; Chidambaranathan and Balasubramanium, 2017 ; Maertens et al., 2017））。目前（qián），含氯化合物（二氯異氰尿酸鈉、次氯酸（suān）鈉、漂白粉、二氧化氯等）廣泛用作畜禽生產中的消毒劑（Van Klingeren，1995；Boxall等，2003）。有效氯能有效殺滅結核杆菌（jun1）、腸杆菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌和（hé）枯草芽（yá）孢（bāo）杆菌。低（dī）濃度的尼（ní）日爾（ěr）孢子（Boxall 等（děng）人，2003 年；Hakuno 等人，2010 年（nián）；Suwa 等人，2013 年）。

        許多研究表明，含氯化合物可以通過改變微生物的細胞膜結構來殺死微生物（Venkobachar et al., 1977 ; Virto et al., 2005 ; Liu et al., 2006 ; Berg et al., 2010）。臭（chòu）氧是一（yī）種三原子氣態分子，可（kě）作為強氧化劑，已在醫學中使用了 150 多年（Elvis 和（hé） Ekta，2011 年）。臭（chòu）氧因其有效的抗菌功能 ( Ozturk et al., 2017 ) 和抗氧化防禦（yù） ( Delgadoroche et al. , 2017) 而具有廣泛的醫療應用）。革蘭氏（shì）陰性菌比革蘭氏陽性菌對（duì）臭氧更敏感，而細菌比測試過（guò）的酵母菌株更敏感（Moore 等人，2000 年）。雅各布斯和海德堡 (1915)首次合成具有殺菌（jun1）能力的季銨鹽化合（hé）物。季銨鹽（yán）的（de）殺菌機製涉及改（gǎi）變細胞通透性，導致細菌內容物外滲。季銨鹽是一種陽離子表麵活性劑。鑒（jiàn）於陽離子（zǐ）表現出基於親脂性的殺菌作用（yòng），並且革蘭氏陽性菌的細胞壁比革蘭氏陰性菌含有更多的（de）脂質，因此革蘭（lán）氏陽性菌更容易被季銨鹽滅活。戊（wù）二醛（quán）可以直接作用於細菌的蛋白（bái）質和（hé）酶（méi），從而影（yǐng）響細菌的（de）新陳代謝，導致細菌死亡。戊（wù）二（èr）醛還可以防止細菌孢（bāo）子外層釋（shì）放二鹽（yán）酸（suān）鹽，防止孢子形（xíng）成。所（suǒ）以，Battersby 等人，2017 年；卡斯特羅等人，2017 年）。戊二醛殺菌譜廣，對細菌和（hé）病毒具有高效殺滅（miè）能力。戊（wù）二醛（quán）對梭狀芽孢杆菌產生的孢子也有（yǒu）很強的作用，可引（yǐn）起壞死性腸炎（yán），因此常用於流行病期間細（xì）菌孢子的消毒（Miner et al., 1993 ; Rutala et al., 1993 ; Brantner et al . ., 2014 年）。

        在（zài）集約化養殖過程中，家畜和家禽可以通過糞（fèn）便和呼吸道排出細菌和病毒（dú），包括機會性病原體，並在空氣中（zhōng）產生生物（wù）氣溶膠，可能（néng）危害人類和環（huán）境（Hojovec 和（hé） Fiser，1968 年；Bessarabov 等人， 1972 年；Petkov 和 Tsutsumanski，1975 年；Petkov 和 Baĭkov，1984 年；Petkov 等人，1987 年；Just 等人（rén），2011a，b）。雞被（bèi）轉移（yí）或淘汰後，空的肉雞舍受到不同程度的汙染。空屋消毒是規模（mó）化養雞場防（fáng）治疾病的重（chóng）要一步。消毒（dú）可以減少或殺死雞舍內潛在的病原微生物，防止病原微生物在批（pī）次間傳播。不同的消毒程（chéng）序有不同的效果，因此選（xuǎn）擇合適的（de）消毒劑以及消毒程序和方法可以有效控（kòng）製禽舍傳染病的發生（shēng）。這些方法（fǎ）主要包（bāo）括清（qīng）洗、浸（jìn）泡、熏蒸、噴塗和紫外線照（zhào）射。霧化消毒劑已經（jīng）應用了半個多世紀。氣溶膠可以（yǐ）節約材料，形成消毒氣溶膠-消毒劑蒸氣係統（Wichelhaus 等人，2006 年；卡瓦略等人（rén），2015 年；Saklou 等人，2016 年）。應用超聲霧化技術，可將液體霧化成（chéng）氣溶膠狀態，獲（huò）得均勻分散的2~4 μm液滴。霧化後的液滴起到“種子粒子”的作用，在氣溶膠中形成聚（jù）集核，可以與（yǔ）周圍的細小顆粒有效碰撞，提高聚集效率。消毒劑霧化後，空氣中散（sàn）發出大（dà）量水蒸氣，增加室內相對濕度，提高（gāo）消毒劑對細菌壁的滲透能力，增強消毒效果，減少（shǎo）消毒時（shí）間（jiān）（Muñoz等., 2017 年）。

        理想的消毒劑應具有良好的殺滅病原微生物（wù）的能力；性質穩定，不易（yì）受水質、有機物等物理化（huà）學因素的影（yǐng）響；有效控製（zhì）養雞場環境衛生。因此（cǐ），檢測空屋消毒後殘留的微（wēi）生物是評價消毒效果的重要手段。許（xǔ）多方法可用於微（wēi）生物氣溶膠（jiāo）檢測，例如微生物培養（yǎng）計（jì）數、直接顯微檢測、生物傳感器技術和基因（yīn）芯片技術。這（zhè）些方（fāng）法是傳統的，無法準（zhǔn）確檢測不易培養或（huò）空氣中含量（liàng）低的微生物。高通（tōng）量 DNA 測序方法可用於通過 16S rRNA 序列分（fèn）析來表征（zhēng）微生物（wù）係統。(Korajkic 等人，2015 年；賈等人，2016 年（nián））。該技（jì）術的優勢在於能（néng）夠檢測培養方法難以獲得的微生物；因此，該技術已廣泛應用於許多領域（O'Brien et al., 2014 ; Tian et al., 2017）。高通量（liàng）測序技術可用於（yú）評估消毒對空屋內微生物分布和微生（shēng）物群落結構的影響。本研究采用（yòng）五種（zhǒng）常用消毒劑對禽舍進（jìn）行消毒。通過 16s rRNA 的高通量測序分析了處理（lǐ）後存在的微生物群的組成，並與未處理房屋中的微生物群進行了（le）比較。研究了（le）不同消（xiāo）毒劑（jì）對空置肉雞舍內微生物數量和多樣性的影響。本研究為消毒劑在疾病預防中（zhōng）的正確應用和消毒程序的（de）製定（dìng）提供參考。

結果與（yǔ）分析

消毒劑處理和未處理的肉雞舍內好氧菌的含（hán）量（liàng）和粒徑分布

未經處理和用消毒劑處理的肉雞舍中的氣溶膠濃度如圖2所示。經過處理的（de）房屋的細菌負（fù）荷低於未經處理的房屋。經（jīng）不同消毒劑（jì）處理（lǐ）後，有效氯和混合消毒劑處理的肉（ròu）雞舍細菌氣溶膠濃度很高和很低，分別（bié）為（wéi）7.67×10 2 cfu/m 3和0.22×10 2 cfu/m 3。顯然，混合（hé）消毒劑對培養細菌的效果優於其他四種消毒劑（jì）（P < 0.05）。

圖 1.未經處理（lǐ）和（hé）經消毒劑處理的空氣中的細菌總數 ( n = 9)。A：無（wú）需消毒；B：臭氧；C：有效氯；D：季銨鹽（yán）；E：戊二醛；F：混合消毒劑。

如表1所（suǒ）示，與未經處理的雞舍相比，經消毒（dú）劑處理的肉雞舍中空（kōng）氣中需氧菌的粒徑分布發生（shēng）了顯著變化（huà）。從 Andersen-6 集塵器的 III-VI 階段開始，用不（bú）同消毒劑處理的肉雞舍中空氣中需氧菌的分布有所減（jiǎn）少。與未用（yòng）消毒劑處理的空雞（jī）舍相比，有效氯、季銨鹽、戊二醛和混合（hé）消毒劑（jì）消毒的肉雞舍在（zài）Ⅲ~Ⅵ階段的分布顯著降低。在（zài）混合消毒劑（jì）處理的肉雞舍中，V-VI階段空氣中需氧菌的比例較（jiào）消毒前的比例從35.1%顯（xiǎn）著下降到0%，戊二醛從35.1下降（jiàng）到1%。

表 1.未經消毒劑處（chù）理和（hé）處（chù）理過的細菌的（de）分級分布。

通過高通量測序進行序列分析

在對空（kōng）氣傳播細菌中細菌 16S rRNA 基因的 V4-V5（515F-907R）區（qū）域進行測序（xù）後，樣本中的原始序列總數（shù）為 531,093。過（guò）濾低質量序列後，有效序列總數為508,143。在對序列進行質量控製後，將序列聚類到 OTU 中，以 97% 的同一性進行分類。所有樣（yàng）本共產（chǎn）生 1995 個 OTU（補充表S1），平均長（zhǎng）度為 372 bp。每個樣品的序列信息如表2 所示。

表 2.樣品的序列信息。

微生物群落結構分（fèn）析

在微生物分類門水平（圖2A)，未處理或經五種消毒劑處理的肉雞舍內采集的空氣傳播微生物主要包括變形菌門、擬杆菌門、放線菌門和厚壁菌門。這些（xiē）門經臭氧、有效氯、戊二醛和混合消毒劑處理（lǐ）後占優勢，相對（duì）豐（fēng）度分別為99.0、97.9、99.8和99.9%。未經消毒劑處理或消毒劑處理的肉雞舍中空氣傳（chuán）播（bō）的微生物在（zài）門水平上存在差異。未經處理的雞舍總（zǒng）共有 32 個門，而用臭氧、有（yǒu）效氯、季銨鹽、戊二醛和混合消毒劑處（chù）理的肉雞雞舍的門數分別（bié）為 21、27、28、17 和 6 個. 使用混合消毒劑後OTU的相對豐度很低（dī）。

圖 2.門水平(A)和屬（shǔ）水平(B)的群落分類組（zǔ）成和豐（fēng）度分布。a、臭氧；b、有效氯；c、季銨鹽；d、戊二醛；e、混合消毒劑；f、未經消毒。

微生（shēng）物群落多樣性分析

采用 Chao1 指數、ACE 指（zhǐ）數、Shannon 指數和 Simpson 指數評估樣品中（zhōng）微生（shēng）物物種的豐度和（hé）多樣性（表3）。不同樣本的（de）多樣性指標不同。未經消毒的肉雞舍的多樣性（xìng）指數高於其他雞舍（shě）的指數（shù），說明未（wèi）經消（xiāo）毒的肉雞舍的生物多樣性（xìng）比較豐富。但經混（hún）合消毒劑（jì）處理後，肉雞舍樣（yàng）品的Chao 1和ACE豐度指數較其他（tā）樣品有所下降。混合消毒劑的多樣性指數很低，表明其消毒效果優於其他消毒劑（jì）。此外，主坐標（biāo）分析（PCoA）顯示各個樣本之間（jiān）存在（zài）明顯的聚類，來自未處理房屋（wū）的樣（yàng）本聚集在一起並與其他處理房屋樣本分離（lí）（補充圖S1）。

表（biǎo） 3.樣品中細（xì）菌（jun1） α 多樣性的統計分析。

聚類分析

基於可在門級別分（fèn）類的 35 種不同分類法構建了熱圖（圖3 ）。圖中的每個小方框代表樣本中某個細菌門的相對豐度。更強烈的紅色代表增加（jiā）的相對豐度。如熱圖（tú）所示，不同樣（yàng）品中微生物群落的組成不同。未經處理的肉雞舍空氣中微生物群（qún）落豐度很高，多種消毒劑聯（lián）合處（chù）理後該豐度（dù）明顯下降。

圖3.門級細菌的相對豐度。a、臭氧；b、有效氯；c、季銨（ǎn）鹽；d、戊二醛；e、混合消毒劑；f、未經（jīng）消毒。熱圖基於行Z分數進行顏色編（biān）碼。比例尺是六（liù）個樣品中細菌相對百分比的標準（zhǔn）化Z值（zhí）。顏色代（dài）碼（mǎ）表示相對豐度，範圍從藍色（低豐度（dù））到黃色到紅色（高豐度）。