臭氧去除食品（pǐn）加工設備中的熒光（guāng）假單胞菌生物膜的研究

食（shí）品（pǐn）加工環境和設備內生物膜的（de）形成增加了產品（pǐn）變質和（hé）病原體汙染的風險。就地（dì）清洗(CIP)操作在去（qù）除土壤和消毒處理設備(包括消除（chú）生物膜)方麵非常（cháng）有用。然而，CIP是一個資源密集型的過程，特（tè）別是在化學洗滌劑，熱和消毒劑的使用（yòng）方麵。本研究旨在探討將臭氧整合到CIP操作（zuò）中的可行（háng）性，以促進假單胞（bāo）菌生物膜的消除（chú），其長期目標是減少對傳統清潔和消毒試劑的依賴。為了研究（jiū）臭氧與（yǔ）CIP的結合，在一個中試（shì）食品加（jiā）工設（shè）備上，在10%脫脂牛奶(脫脂牛奶-水混（hún）合物，1:9 v/v)中培養2天，在靜止條件下培養出熒光（guāng）假單胞菌，然後在添加10%新鮮脫脂牛奶的情況下再循環5天。CIP采（cǎi）用22-25℃水洗，50℃0.2%氫氧化鉀堿性清洗，很後用水衝洗。這些CIP操作將浮遊細胞數量減少到低於檢測方法的極限，但並沒有從加工設備的光滑或粗糙表麵（miàn）完全去（qù）除熒光假單胞菌生物膜。當（dāng）CIP過程之後應用含水臭氧步驟(10 ppm, 10分鍾)時，處理減少了光（guāng）滑和粗糙表麵的生物膜細胞數（shù）量（liàng），低（dī）於回收方法的檢測限(分別為0.9和1.4 log CFU/ 100 cm2)。這些結果證（zhèng）明了臭氧輔助（zhù）CIP在（zài）去（qù）除加工設備上的微生物生物膜方麵的效用，但需要進一步研究以優化清洗劑的使用（yòng）和臭氧的應用。

1. 介（jiè）紹

在食品加工環境中，對致病菌(如假單胞菌和單核增生李斯特菌)的控製一直是一個（gè）難點。在適當（dāng）的水（shuǐ）分和營養條件下，這些細菌可以在食（shí）品加工設備上快速形成生物（wù）膜(Brooks and Flint, 2008)。由此產生的（de）生物膜（mó）是食品重（chóng）複汙染的持續來源，這在很大程度上影響了產品的保質（zhì）期和安全性。事實上，生物膜在食（shí）品行業，特別是乳製品（pǐn）行業中（zhōng）的作用已經得到了廣泛的研究(Panebianco等人，2022)，研究人員發（fā）現，細菌可以在乳（rǔ）製品加工操作（zuò）的幾個環節和加工設備的許多部分形成生物膜(Marchand等人，2012)。變質微生（shēng）物如假單胞菌的生物膜被認為是乳品加工（gōng）操作中的（de）一個具有挑戰性（xìng）的問題。假單胞菌屬的（de）成員無處不在，經常從乳（rǔ）製品生產設備或乳製品（pǐn）中分離出來（lái）。假單（dān）胞菌產生耐熱脂肪酶和蛋白酶，這些酶（méi）在牛奶熱處理後會持續存在，從而通過產（chǎn）生不良風味和氣味導致很終產品變質(Zhang等人，2019)(Reichler等人，2021)。幾種假單胞（bāo）菌通常從乳製品工廠分離出來;其中包括熒光假單胞菌、fragi假單胞（bāo）菌、惡臭假單胞菌、嗜蟲假單胞（bāo）菌和銅綠假單胞菌(Chiesa et al.， 2014)。

就地清洗(CIP)操作旨在通過盡量減（jiǎn）少加（jiā）工過程中的產品再汙（wū）染來確保（bǎo）加工（gōng）食品的安全(Seiberling, 1997)。CIP係統去除設備內部（bù）表麵沉積的材料（liào），無需打開或拆卸設備，很少或根本（běn）不需要人工（gōng）操作（zuò）(Smithers, 2022)。傳統的（de）CIP操作在去除食品接觸麵上形成的生物膜的效果上各不相同(Dufour等（děng），2004)。這種操作通常（cháng）由以下步驟組成:(1)用水衝洗;(2)堿清洗，或不加（jiā）酸洗;(3)衛生處理。消毒步驟的設計是為了保持（chí）設備足夠（gòu）的衛生條件。這一步驟通常涉及使（shǐ）用殺菌劑，包括氯、過氧乙酸、碘劑或季銨化合物(Joseph et al.， 2001)。然而，處於生物膜狀態（tài）的細（xì）菌可以對這些（xiē）殺菌劑的抗菌作用產生保護作用(Srey et al.， 2013;Wassenaar et al.， 2015)。大量（liàng）使用這些殺（shā）菌劑可能會對（duì）人（rén）類健康（kāng）產生負麵影響，並導致加工設備（bèi）惡化(Marino et al.， 2018)。作為（wéi）一種替代消毒劑，臭氧在食品工業中已（yǐ）被廣泛應用，並被批準（zhǔn）用於食品處理（lǐ）、儲存（cún）和加工(食品和藥物管理局，2001年)。臭氧的特點（diǎn）是對許多致病性和腐敗微生物具有很強的抗菌活性，並因其對（duì）環（huán）境的影響很小而被認為是一種環保消毒（dú）劑（jì）(Pascual等（děng）人，2007;Marino et al.， 2018;Masotti等人，2019;Bigi et al.， 2021)。臭氧通過多種機製破（pò）壞（huài）微生物的細胞質膜和其他細胞成分，包括氧化不飽和脂質、蛋白質和（hé）核酸，從而使微（wēi）生物失活(Khadre et al.， 2001)。臭氧還可以阻止微生物（wù）細胞與（yǔ）表麵的初始附著，並（bìng）通過破壞（huài）參與細胞的細胞外基質來抑（yì）製生（shēng）物膜的形成(Panebianco et al.， 2022)。

假單胞菌在加工環境中形成（chéng）生物膜是食品工業中一個（gè）相當大的問題，它可能導致（zhì）產品變質和疾病爆發(Srey等人，2013)。關於假單胞菌（jun1）生物膜在工業環境下的生成和臭氧對這種生物膜的使用的係統研究是缺乏的。因此，本研究（jiū）的目的是:(1)研究（jiū）當脫脂（zhī）牛奶(乳製品的一個例子)作為營養來源時，熒光杆菌在中試規模的食品加工設備上形成堅固的（de）生物膜的能力（lì）;(2)評估（gū）在CIP淨（jìng）化（huà）過程中使用臭氧（yǎng）作為消毒劑的生物膜控製技（jì）術的效果（guǒ）。

2. 材料與方法

2.1. 臭氧輔助就地清洗係統

臭氧輔助CIP係（xì）統（tǒng）(圖1)是俄亥俄州立大（dà）學的研究人員和一（yī）家臭氧設備製造商(Del ozone, San Luis Obispo, CA)合作（zuò）為本研究定製（zhì）的。該係（xì）統(圖1)由一（yī）個132升的容器(用於存放漂洗水)，三個57升的容（róng）器（qì）(用於存放堿性溶液，酸性溶液和消毒劑)，一個熱交（jiāo）換器(型（xíng）號（hào）:STFT-6000-240;TruHeat, Richmond Hill, ON, Canada)，一個泵，以及測量湍流（liú），溫度，pH值和電導率（lǜ）的儀表。離心泵（bèng）(Gould離心泵，型（xíng）號NPE 1ST1F5B6, Seneca Falls, NY)用於將CIP流體循環到中試規模的食品加工設備，並由GS AC Drive (Automation Direct, Cumming, GA)調節。監測和數據采（cǎi）集使用兩個流量計(Blue-White Industries F-1000, Huntington Beach, CA)，兩個熱電偶(Omega, Stamford, CT)，一個pH計(Jenco Instr。(Emerson/Rosemount Analytical Model 1056 Dual Input Analyzer, Shakopee, MN)，兩個電導率探頭(Emerson)。這些（xiē）探頭被放置在CIP係統的入口和返回線中，與（yǔ）加工設備相關。CIP設備的設置方式是，通過打開適當的閥門，CIP泵可以從任何單個容器(水，堿性，酸性或消（xiāo）毒劑)中（zhōng）抽（chōu）出流體（tǐ），並通過噴霧球將流體引導到加工設備;然（rán）後，水流將流經所有的加工生產線，並將（jiāng）水返回到啟動（dòng）水箱，或者簡（jiǎn）單地通過加熱器將水再循環並返回到（dào）水箱以控製溫度。臭氧衛生係統(Del ozone AGW 4045)具有內置臭氧發生器和（hé）控製器(Del ozone Genesis CD-45GV)，與CIP係統集成在一起。滑板的臭氧部分有自（zì）己的循（xún）環回路，帶有第二個泵(型（xíng）號:NPE 1ST1F1B4，古爾德泵)，在使（shǐ）用過程中不斷產生和維持臭氧化水。臭氧係統的（de）設置（zhì）使（shǐ）CIP泵可以從主臭氧水（shuǐ）罐中抽取水。

圖1.代（dài）表與臭氧發生器集成並結合中（zhōng）試規模（mó）食品加（jiā）工設備的中試規模原（yuán）位清洗係統。

2.2. 中試食品加工設備

CIP係統連接（jiē）到模擬食品加工設（shè）備的中試裝置上，該設（shè）備由304級不鏽鋼（gāng）製成(圖2)。加工設備的構造便於在清洗（xǐ）過程中連接到CIP係統。加（jiā）工設備包括:(a) 190-L的罐(容（róng）器)，(b)放（fàng）置在較大管道內的填料閥，(c)管三通，(d)旁通管線，(e)四個小管（guǎn）段(內徑2.54 cm，長5.08 cm，內表麵積40.5 cm2)，使用粗砂碳化矽球筒磨具(Brush Research manufacturing, CA)人工製造表麵粗糙（cāo）的管段（duàn），(f)四個90°彎頭(內徑2.54 cm，內表麵積117.0 cm2)，表麵光滑，(g)回流泵(古（gǔ）爾德泵)，型（xíng）號NPE 1ST1C5E6)，和(h) 7.6米（mǐ）(25英尺)的（de）2.54厘米直徑管。

圖2.實驗裝置的表示，包括用於汙染中試（shì）規模加工設備和在不鏽（xiù）鋼表麵上開發乳品生物膜的結垢係統。汙垢設備由以下部分組成，如圖所（suǒ）示：（1）19-L高密（mì）度聚（jù）乙（yǐ）烯容器，（2）帶4.8毫米穿孔的內部過濾器（qì），（3）在線路上的三（sān）個外部過濾器，網孔尺寸（cùn）為20，40和40，（4）循環蠕動（dòng）泵（bèng），（5）進料（liào）管（guǎn）路蠕動泵，（6）5-L進料瓶， （7）插（chā）入氯（lǜ）丁橡膠管的小不鏽鋼管。加工設備的組成（chéng）包括：不鏽鋼T型管（8），旁通閥（9），填料（10），旁通管（11），四（sì）個粗糙表麵管段（12）和四個光滑表麵90°彎頭（13）。

2.3. 汙染係統（tǒng）

所需的實驗（yàn）生物膜需要是堅（jiān）固的，並模擬當（dāng）食品加工設備（bèi）的清潔被忽（hū）視或效率（lǜ）低下時自（zì）然會發生的情況。為了使研究易於（yú）管理和實驗可（kě）重複，生物膜在（zài）7天的過程中生（shēng）成（chéng）。為了生成這種生物膜，研（yán）究人（rén）員開發了一種汙染係統，該係統由一個（gè）19-L高密度（dù）聚乙烯容器組成，該容器可容納7.6 L接種的生長培養基，然後在係統中緩慢循環。該設備有一個四步過濾係統，可以在流體流到達泵之前將（jiāng）較大（dà）的顆粒從流體流中去除。第一個過（guò）濾器作為（wéi）吸力過濾器放（fàng）置在容器（qì）內(4.8 mm穿孔;麥克馬斯特-卡爾，哥倫布市，俄亥俄州)。其他三種過濾器(濾網尺寸分別為（wéi）20、40、40;麥克馬斯特-卡爾)是外部的容器，設計用於在汙染運行過程中拆卸和清潔，而無需拆（chāi）卸（xiè）整個係統或排水。通過過濾器後，流體進（jìn）入（rù）蠕動泵(Masterflex型號:7553-70;Masterflex頭型（xíng）號（hào）:7015;Barrington, IL)，它被指定為“循環泵”，通過（guò）目標處理設備部（bù）件傳輸（shū）汙染流體(圖（tú）2)。第二個5-L儲液器包含滅菌介（jiè）質，連接到第二個蠕動泵(Masterflex型號:7521-50;機頭型（xíng）號:7016;Masterflex)被綁在汙染係統（tǒng）的輸入線上，慢（màn）慢地添加新鮮培（péi）養基（jī），以保持生物體（tǐ）在多天（tiān）的孵化中生長。汙垢係（xì）統包含多個小的不鏽鋼管(每根內徑為6.35 mm，長9.05 mm，內（nèi）表麵積為（wéi）3.78 cm2)插入壬二烯管(06402-15;科爾·帕默，弗（fú）農山莊，伊利諾伊州);這些試管用於檢測熒光（guāng）假單胞菌汙（wū）染期間生（shēng）物膜形成的穩健性。

2.4. 熒光假（jiǎ）單胞菌培養物的製備

熒光假單胞菌（jun1）ATCC 25289來自（zì）俄亥俄州立大學(Columbus, OH)微生物係的培養標本。將細菌的冷凍（dòng）培養基傳（chuán）代於胰酶豆湯(TSB;Becton Dickinson & Co.， Sparks, MD)，並在搖床培養箱(New Brunswick Scientific Co. Edison, NJ)中輕度攪拌，在30°C下孵育48小時。將（jiāng）熒光假單胞菌培養物鋪在（zài）胰蛋白酶大豆（dòu）瓊脂(TSA)上;Becton Dickinson & Co.)，在環境溫度(22-25°C)下孵育48小時，然後在TSB中傳代，然後用於實驗(Meyer和Abdallah, 1978)。

2.5. 熒光假單胞菌生（shēng）物膜發育

為了誘導生物膜的形成，在7.6 l容量（liàng）的汙染係統中進行如下（xià）操作。脫脂牛奶(Kroger Co.， Cincinnati, OH)， 760 mL，用蒸餾水（shuǐ）稀釋至總積（jī）7.6 L，然後在121°C高壓滅菌30分鍾（zhōng）;這將被稱為（wéi）“生物膜培養（yǎng）基（jī）”。生物膜培養基冷卻至室溫(22-25℃)後，接種38 mL (0.5% v/v) P. fluorescens ATCC 25289培養物。接種的生物膜培養基在循環（huán）中（zhōng）循環30 min，停滯2 d，然後以1.5 ~ 2.0 L/h的速度恢複循環5 d。接種後的培養基在主汙染回路循環（huán）的同時，在5-L瓶中填充新鮮的生物膜培養基，用第二蠕動（dòng）泵以125 mL/h的速度泵送內容物，為熒（yíng）光假單胞菌（jun1）繼續生長添加新的（de）營養物質(圖2)。

在生（shēng）物膜發育（yù）過程中（zhōng），生物（wù）膜樣品(即（jí）汙染回路不鏽鋼管)在以下時間點取出（chū）:循環開始（shǐ）前(即2天停滯孵化後)和循環5天期間每天取出。每（měi）個生物膜樣品由2管（guǎn）組成，一管用於熒（yíng）光假單胞菌計數，另一（yī）管用於掃描電鏡檢查。

2.6. 使用臭氧輔助CIP去除食品加工設備中的熒光假單胞菌生物膜

在進行實（shí）驗（yàn）之前，用洗滌劑溶液清洗所有加工設備的元件並漂洗。除產品罐外，這些元件在121°C下高壓滅菌30分鍾。在實施CIP之前，為了在設備上形成生物膜，在罐和出口管道之間添加汙染（rǎn）液，並允許（xǔ）流過填料、旁（páng）路、5.08厘米的小管段（duàn）和彎頭，然後（hòu）返回汙染回路。初步試驗表明，該加工槽易於（yú）清洗，因此，該加工槽出口管道是研（yán）究的主（zhǔ）要對象。因此，受汙染的（de）部件為t形管(8)、旁通閥(9)、填料(10)、旁通（tōng）管線(11)、4個表麵粗糙的小管段(12)和（hé）4個表麵光滑的90°彎頭(13)。接種後的生物膜培（péi）養基先在（zài）循環中循環30分鍾，停滯2天（tiān），然後恢複循環5天，如上所述。在形成堅固的熒光假單胞菌（jun1）生物膜後，CIP工藝按以下步驟依次實施:(1)預漂洗，(2)漂洗後的堿性清（qīng）洗，(3)臭（chòu）氧消毒。管段(圖2，組件12)和彎頭(圖2，組件13)是用來評估CIP步驟去除熒光假單胞菌生（shēng）物膜有效性的部分。每個CIP步驟後，去除一個節段和肘部，替換新鮮無菌部分，並（bìng）擦拭其內（nèi）表麵以評估生（shēng）物膜去除情況。

2.6.1. 除去

一旦生（shēng）物膜（mó）形成過程完成，被汙（wū）染的處理設備（bèi）連接到CIP係統，隨後去除汙染係統。采用過濾35 μm的自來水，在22-25℃溫度下進行預（yù）升。衝洗水由水箱經CIP進（jìn）口泵以56.7 L/min的速度單次（cì）輸送，保證湍流流動;流體的流速為1.87 m/s。衝洗時間確定為1 min，以確保去除所有乳土。

2.6.2. 堿性的清潔

用水預漂洗後，將過濾35 μm的自來水與堿性洗滌劑(CIP 100;Steris, Mentor, OH)，達到0.2%的濃度（dù）。通過在線加熱器循環，將溶液加熱至50°C。溫度由溫度（dù）控（kòng）製器(歐姆龍E5C2, Allied Electronics & Automation, Worthington, OH)管理。待溫度穩定後，向加工設備內充入堿性溶液，以56.7 L/min的速（sù）度循環2 min。清洗過程中控製溫度(50±2℃)和流速(1.87 m/s)。

2.6.3. Post-rinse

後衝洗消除了被清洗係統中的堿痕跡（jì），並冷卻了係統，使其為臭氧消毒做好準備。經過35 μm過濾的自來水從（cóng）用於水預衝洗的水箱中取出。將漂洗水引入係統，並測定了（le）溶液在進出口線的電導率。當水電導率達到所需值(22-25℃下300-320 μsc)時，再繼續衝洗1分鍾，直至衝洗完畢並關閉水泵。水流穩定在56.7 L/min。

2.6.4. 臭氧衛（wèi）生處理

在環境溫度(22-25°C)下使用臭氧水溶（róng）液作（zuò）為消毒劑。空氣作（zuò）為臭氧發生器的入口氣（qì）體，因為它有一個集成的氧氣濃縮係統。用電暈放電法將濃氧轉化為（wéi）臭氧，並借助文丘裏裝置與（yǔ）水混合。將臭氧水溶液儲存在（zài）臭氧-水箱中(圖1)，通過離心泵(古爾茲泵型號:NPE 1ST1F1B4)在文丘裏腔內（nèi）循環，直（zhí）至達到所需濃度。過量（liàng）的（de）臭氧由熱催化臭氧破壞裝置(Del ozone)去除。在該研究中（zhōng）測試了5 ppm或10 ppm的含水臭氧。低濃度（dù）(5ppm)應用5min, 10ppm的臭氧溶液測試10min。溶液中臭（chòu）氧（yǎng）濃度由（yóu）臭氧監測儀(Q450;ATI，學院維爾，賓（bīn）夕法尼亞州)在進口和出口線。此外，通過分光光度計(Spectronic 1201, Milton Roy Co.， Houston, TX)在258 nm (A258)處測（cè）量紫外吸收，采（cǎi）用（yòng）紫外光譜法確定了水溶液中臭氧的濃度。

2.6.5. 臭氧輔助CIP係（xì）統的抗菌膜（mó）效果

改進的CIP係統對未附著的(浮（fú）遊)和附著的(生物膜)熒光（guāng）假單胞菌細（xì）胞群的有效性進行了評估。浮遊細胞的樣本（běn）從CIP回路回路上的隔膜取樣口采集(圖1)。這些樣本在清（qīng）洗過程開始前，在預漂洗、後漂洗堿（jiǎn）性清洗和臭氧消毒（dú）後，使用10cc注射（shè）器(Becton, Dickinson & Co.)采集。在0.1%蛋白（bái）腖水中進行連續稀釋，並（bìng）使用灌注鍍技術將（jiāng）1ml等分液與熔（róng）融TSA (Becton Dickinson & Co.)混合(Yousef et al.， 2022)。30℃孵育48 h，計數（shù）菌（jun1）落。第二種類型的采樣是為了推斷清潔過程（chéng）對生物膜細胞的有效性。生物膜樣品取自粗糙和（hé）光滑表麵;這些（xiē）分別是不鏽鋼節段(圖2，組件12)和彎頭(圖2，組件（jiàn）13)。為了評估（gū）CIP對熒（yíng）光假單胞菌生物膜種群的影響，在（zài）整個清洗過程開始前，在（zài）預漂洗、後漂洗堿性清洗和（hé）臭氧消毒後，分別去除一段和一個肘部。將切除的切片（piàn）替換為無菌切片，並恢複清洗過（guò）程。

2.7. 生物膜的枚舉

為了確定汙（wū）染裝置形成的生物膜，在5天的生物膜介質（zhì）循環中（zhōng），每（měi）天從汙染（rǎn）回路(圖（tú）2，組件7)中取出兩根小不鏽鋼（gāng）管，以監測（cè）強健生（shēng）物膜的發展。將每個（gè）不鏽鋼管無菌放入含有25 mL 0.1%蛋白腖水的50 mL螺旋蓋小瓶中。手動（dòng）搖瓶，然後用另外10ml 0.1%蛋白腖水衝洗試管，以去（qù）除（chú）未附著的細胞。用兩根無菌棉簽拭除管內表麵（miàn）的（de）生物膜細胞，將（jiāng）棉簽尖端斷開，放入含（hán）有9ml 0.1%蛋（dàn）白腖（dòng）水的玻璃管中。管，包括拭子，在旋渦混合器(Fisher Scientific Industries, Inc.， Bohemia, NY)中混合約30秒。將得（dé）到的懸浮液用0.1%蛋（dàn）白（bái）腖水稀釋，用倒鍍法將其鍍在TSA上，並在30°C下孵育2天(Yousef et al.， 2022)。每管平均（jun1）CFU換算為CFU/ cm2。

為了（le）在臭氧輔助CIP過程中（zhōng）對熒光p.h ncens生物膜進行計數，用三根無菌棉簽(Fisher Scientific)擦拭不鏽鋼節段和肘部的內表麵（miàn），將生物膜細胞從（cóng）棉簽的尖端分離到含有25 mL 0.1%蛋白腖水的（de）管（guǎn）中。包括拭子在（zài）內的（de）試管在旋渦混合器（qì）中混合約30秒。將得到（dào）的懸（xuán）浮液用0.1%蛋白腖水稀釋後，用倒鍍法鍍（dù）在TSA上，在30℃下孵育2天（tiān）。每節平均CFU數換（huàn）算為CFU/100 cm2。

2.8. 掃描電子顯微鏡（jìng）對生物膜的檢查

為了用（yòng）掃（sǎo）描電鏡檢查（chá）小不鏽鋼管內的生物膜，需要（yào）一（yī）些準備;這些準（zhǔn）備工作按照之前的描述進行(Speers等人，1984;Latorre et al.， 2010)，並做了一些修改。從汙染係統中（zhōng）取出的試（shì）管，用10ml 0.1%蛋（dàn）白腖水衝洗，然（rán）後放入玻璃（lí）小瓶中。用2.5%戊二醛（quán）固（gù）定於0.1 M磷酸緩衝液中，pH為7.4的葡萄糖溶液中。試管在0.1 M磷酸鹽緩衝液中衝洗3次，每次15分鍾（zhōng），然後將每個試管小（xiǎo）心地縱向切成兩半。半管片在0.1 M磷酸鹽緩衝液中衝洗三次，每次衝洗15分鍾。將（jiāng）洗（xǐ）滌後的（de）含生物膜的半管分別（bié）在增（zēng）加濃度的乙醇(25、50、70、85和95%)中脫水10分鍾，然後（hòu）在100%乙醇（chún）中脫（tuō）水3次，每次30分鍾。將幹燥的樣品安裝（zhuāng）在鋁樁上，並在（zài）濺射塗（tú）層機(Cressington, Redding, CA)中（zhōng）用金塗層2分鍾。對樣品進（jìn）行掃描電鏡成像(Nova 400 NanoSEM, FEI, Hillsboro, OR)。

2.9. 統計（jì）分（fèn）析

實驗至少（shǎo）重複進行，並獨（dú）立重複兩次。數據用兩個獨立（lì）重複的平均值±SD表示，使用統計軟件(GraphPad Prism 9.0.0;GraphPad軟件公司，聖地亞哥，加州（zhōu）)。采用方差分析(ANOVA)，采用Tukey兩兩比較（jiào），確定治療組之間或治療對比較的顯著性差異。p≤0.05認為差異有統計學意義。

3.結論

在中試規模的食品加工設（shè）備上開發堅固的生物膜具有（yǒu）挑戰性;然（rán）而（ér），克服這一限製使我們能夠驗證（zhèng）臭氧輔助CIP是消除熒光假單胞菌（jun1）生（shēng）物膜的有效方法。本研究提供的證據表明，標準的就地（dì）清洗製度使熒光（guāng）假單胞菌浮遊細胞低（dī）於計數法的檢出限;然而，完全消除生物膜細胞是不可能的。在清潔過程中加入臭氧作為消毒劑，可以完全去除加工設備粗（cū）糙或光滑表麵上的生物膜細胞。目前的研究表明，臭氧輔助CIP可以成為（wéi）食品加工商淨化加工設備的有效方法，特別是在乳製品行業。