低濃度臭氧控製紅蘋果李斯特（tè）菌的有效性（xìng）研究

        本研究旨在探討低劑量連續臭氧氣體對紅冠蘋果長期商業（yè）冷藏過程中無害李（lǐ）斯特菌和品質屬（shǔ）性及病害的控製效果。Red Delicious 蘋（píng）果以 ∼6.2 log 10 CFU/蘋果接種三株無害乳杆（gǎn）菌混合物，用或不用 1-甲（jiǎ）基環丙烯處理，然後在商業環境（jìng）中用或不用連續氣態臭氧（yǎng）進行受控氣氛 (CA) 儲存設施 36 周。將經受（shòu）上述儲存條件的未接種紅美味蘋果用於（yú）酵母/黴菌計數和（hé）質量屬性評估。36 周的冷凍（dòng）空氣（qì） (RA) 或（huò） CA 儲存導致約 2.2 log 10 CFU/蘋（píng）果減少（shǎo）無害乳杆菌。與單獨的 RA 和 CA 存儲相比，臭氧氣體的（de）應用導致無害乳（rǔ）杆菌的額外 > 3 log 10 CFU/蘋果減少。在 36 周的 CA 儲存過程（chéng）中，連續施用（yòng）低劑量的氣態臭氧顯（xiǎn）著延緩了（le）酵母/黴菌的生長，延緩了蘋（píng）果的硬度（dù）損失，並且對臭氧燃燒、皮孔腐爛、赤（chì）褐色、CO 2損傷、表麵燙傷、與單（dān）獨 CA 存儲相比，Red Delicious 蘋果的軟燙。總之，連續應用低劑量氣態臭氧有可能控製紅美（měi）味蘋果上的李斯（sī）特（tè）菌，而不會對蘋（píng）果的品（pǐn）質屬性產生（shēng）負麵（miàn）影響。

介紹

        單核細胞增生李斯特菌可在易感人群中引起致命的（de）李斯特菌病，並且死亡（wáng）率很高（CDC，2017）。單核細胞增生李斯特菌廣泛存在於農業環境中。美（měi）國食品和藥物管理局對蘋果（guǒ）和其他即食食品實施零容忍（Shank 等人，1996 年；FDA，2008 年）。蘋果在開放環境中生長，因此在生產或（huò）隨後（hòu）的采後包（bāo）裝過程中可能受到單核（hé）細胞（bāo）增生李斯特菌的感染（ Angelo 等人，2017 年）。單核細胞增生李斯特菌與兩次多州焦（jiāo）糖蘋果暴發有關（Angelo 等人，2017 年；Marus 等人，2019 年（nián））) 以及多個新鮮蘋果品種（zhǒng） ( FDA, 2017 , 2019 ) 和鮮（xiān）切蘋（píng）果 ( FDA, 2016 , 2020b ) 的多次召回。這些暴發和召回（huí）凸顯了蘋果李斯特（tè）菌汙染的風險以及控製蘋果李斯特菌的重要性。收獲（huò）後，蘋果（guǒ）通（tōng）常在受控氣氛 (CA) 冷藏庫中（zhōng）冷藏長（zhǎng）達（dá） 12 個月。在（zài）這種長期儲存過程中進行抗（kàng）菌幹（gàn）預可以為控製新鮮蘋（píng）果上的李斯特菌提供潛在的幹預策略（ Sheng 和 Zhu，2021 年）。

        臭氧是一種強氧化劑和強效抗菌劑，不（bú）會在處（chù）理過的產品（pǐn）上留下任何殘留（liú）物（Guzel-Seydim 等人，2004 年）。臭氧氣體被食品和藥（yào）物管理局批準為公認安（ān）全劑（FDA，2020a），並（bìng）被批準用於有機生產（chǎn）和處理（USDA-NOP，2021）。已經研究了以固定速率在短時間內控製主要食源性病原體的氣態（tài）臭氧，包括大腸杆菌O157:H7（Han 等人，2002 年（nián））、沙（shā）門氏菌（Das 等人，2006 年）和單核細胞增生李斯特菌（Alwi 和 Ali，2014 年；Concha-Meyer 等人，2014 年) 新鮮農產品。例如，10 mg/L 的臭氧氣體可在1 小時（shí）內使番茄上接種的（de）腸炎沙門氏菌減少約 7 log 10 CFU/番茄（Das等人，2006 年）。在（zài） 4°C 下儲存 10 天後，新鮮藍莓上的 4 mg/L 氣態臭氧可將單核細胞增生李斯特菌減少 3 log 10 CFU/ml（ Concha-Meyer 等人，2014 年）。20 分（fèn）鍾的氣（qì）態臭氧 (23 mg/L) 暴露導致帝國蘋果上單核細胞增生李斯特菌的（de） 2.1–3.1 log 10 CFU/蘋果減少（Murray 等人，2018 年）。還研究了臭氧氣體以控製不同（tóng）蘋果品種在儲存（cún）期間的常駐微（wēi）生物群（Yaseen 等，2015）。在 1°C 儲存條件下，暴露 0.5 mg/L 的臭氧氣體 60 天（tiān）會導致（zhì）新鮮蘋果上的擴展青黴減少 2.7-4.0 log ，具體取決於品種（Yaseen 等人，2015 年）。

       此外，在（zài）儲存期間（jiān）使用（yòng）臭氧氣體有利於保持（chí）水果品質。例如（rú），據報道，1-3 毫克/升的臭氧暴露可保持蘋（píng）果的硬度（dù）（Antos 等人，2018 年）並減少蘋果的重量損失（shī）（Juhnevica-Radenkova 等人，2019 年）。我們之前表明，在 CA 儲存中連續應（yīng）用（yòng） 30 周 87 μg/L 的氣態臭氧可將富（fù）士蘋果上李斯特菌減少 5.0 log 10 CFU/蘋果，而不會對蘋果果實（shí）質量產生負麵影（yǐng）響。盛等人，2018）。然而，這種影響不（bú）能直接轉移到其（qí）他蘋果品種，因為每個蘋果品種都有（yǒu）其獨特的表皮（pí）蠟和常駐微生物（wù）群組成，這些成分會影響李斯特菌的持（chí）久性和對抗菌幹預的（de）反應（Chai 等人，2020 年（nián）；Ku 等人，2020 年；Abdelfattah 等人）等，在（zài）新聞中）。

        Red Delicious 蘋果是美（měi）國很暢銷的蘋果品種之一（USAA，2019 年），很（hěn）近（jìn）因潛在的單核細胞（bāo）增生李斯特菌汙染而被召回（FDA，2019 年）。與其他商業化種植的蘋果品種（zhǒng）相比，Red Delicious 蘋果（guǒ）特（tè）別容易出現水核（hé），在長期 CA 儲存期間發生內部疾病（例如（rú）內部褐變）的風險增加（Mattheis，2008 年），進一步導致蘋果產業遭（zāo）受損（sǔn）失（shī）。本研究的目的是（shì）研（yán）究（jiū）不同商業儲存方式與不同（tóng）劑量的連續（xù）氣態臭氧在控製無害李斯特菌方麵的效果，在有或沒有 1-甲基環丙烯 (1-MCP) 預處理的 Red Delicious 蘋果上與（yǔ）L. monocytogenes ( Buchrieser et al., 2003 ) 在係統發育上相關（guān）。進一步評價了紅冠（guàn）蘋果在不同貯藏條件下品質屬性的維持（chí）情況。

材（cái）料和方法

無害李斯特菌培養準備

        兩種L. innocua 食品分離物，NRRL 33314 和 NRRL 33554，以及（jí）一種（zhǒng）加工廠分離物L. innocua，NRRL 33197，來自 USDA-ARS 培養物保藏中心 [National Center for Agriculture Utilization Research (NRRL), Peoria, IL, United州] 並儲存在添加 0.6% 酵母提取物 (TSBYE；Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, United States) (TSBYE) 和 20 -80°C 下的 % (v/v) 甘油。每個冷（lěng）凍培養物在 TSBYE 中（zhōng）在 37°C 下連續轉移兩次 24 小（xiǎo）時。通過組（zǔ）合等量的單個L. innocua菌株（zhū）來製備三菌株雞尾酒接種物。個體（tǐ）L. innocua通過在 TSAYE（含 1.5% 瓊脂的 TSBYE）板上連續稀釋和（hé）鋪板來計數菌株或三菌株混合物。

蘋果接（jiē）種

        新鮮未上蠟（là）的紅美味蘋果，在（zài）商業成熟時手動收獲，康奈爾澱粉指數顯示範圍為 2.8-3.5（Blanpied 和 Silsby，1992 年），儲存在商（shāng）業儲（chǔ）藏室（亞基馬，華（huá）盛頓州，美國），溫（wēn）度為 ∼ 1°C 並在研究前送到（dào）實驗室。本研究選擇了沒有割傷（shāng）、瘀傷或疤（bā）痕的（de）蘋果（~200 克）。對於L. innocua接種，將蘋果浸（jìn）入在無菌磷酸鹽緩衝鹽水（1 × PBS，pH 7.4）中稀釋的三（sān）株L. innocua接種物中（zhōng），以獲得約 6.2 log 10的接種水平CFU/蘋果。接種後的蘋果在室溫（~22°C）下放（fàng）置 24 小時，然後進行相（xiàng）應的（de）儲存。分別在 0 和 24 小時（shí）隨機抽取 40 個接種蘋果，以確認初始細菌水平和接（jiē）種的均勻性。

蘋果（guǒ）的貯藏處理

        接種後 24 小時的蘋果被隨機裝（zhuāng）入塑料箱中；每箱 40 個蘋果。將盒裝接（jiē）種（zhǒng）過的蘋果（guǒ）隨機分（fèn）成6組，其中一半在貯藏前（qián）用1.0 mg/L 1-MCP氣態空氣處理24 h。然後將蘋果置於冷凍空氣 (RA; 0.2 ± 0.1°C) 和 CA (0.2 ± 0.1°C, 3.1 ± 0.0% O 2 , 0.4 ± 0.0% CO 2 ) 中，有或沒有 60.2 ± 5.7 或78.7 ± 13.2 μg/L 在半商業 RA/CA 房間（3,200 ft 2）在商業設施（Stemilt Growers LLC，Wenatchee，WA，United States）中的相對濕度約為 90%。臭氧氣體由商用臭氧發生器產生，並（bìng）通過比例-積（jī）分-導數算法自動轉（zhuǎn）移到儲存室，以在儲存期間將臭（chòu）氧劑量保持在目標水平。臭氧濃度在儲存的第一周開始，在第四周開始時達到目標濃度。同時，分離的（de）未接種蘋果組被包括在上述儲存條件中，用於居民微生物區（qū）係計數和蘋果品質評（píng）價。

        接種後的蘋果在儲存 3、6、12、18、24、30 和 36 周後取樣，用於L. innocua計（jì）數（shù）。在儲存 6、12、24 和 36 周後對未接（jiē）種的蘋果進行取樣，以測定總平板計數 (TPC) 和酵母（mǔ）/黴菌計數。蘋果質（zhì）量屬（shǔ）性在收獲時和儲存 6 個月和 9 個月時進行評估。每個貯（zhù）藏條件下每個時間點取樣 40 個蘋果用於微生物計數、質量屬（shǔ）性和內（nèi）部（bù）紊亂評價，而（ér）每個貯藏條件下每個時間點采樣 100 個蘋果用於外部紊亂評價，其中每個蘋（píng）果被視為一個實驗（yàn）單元。

無害李斯特菌枚舉

將每個蘋果轉（zhuǎn）移（yí）到裝有 10 ml 無菌 1 × PBS 的胃袋（Fisher Scientific）中，並用手揉搓 80 秒（miǎo）。摩擦溶液用無菌 1 × PBS 連續稀釋 10 倍，鋪在 TSAYE 板上，然後覆蓋改性牛（niú）津瓊脂 (MOX) (BD) 以區分李斯（sī）特菌（jun1）和背（bèi）景細（xì）菌（Shen 等人，2019 年），並在37°C 48 小時（shí）。L. innocua在 MOX 瓊（qióng）脂平板上產生典（diǎn）型的黑（hēi）色菌落，周圍有黑色暈圈。對於低於檢測限（10 CFU/蘋果）的樣品，將 1.0 ml 摩擦溶液在緩衝的李斯特菌富集緩衝液（yè） (BLEB) (BD) 中在（zài） 30°C 下富集 48 小時；李斯特菌的存在/不存在已經報道。將（jiāng）富集培養物分別劃線到（dào） MOX 和 CHROMagar TM 李斯特菌（CHROMagar，Paris，France）平板上，以定性檢測李斯特菌的存在（Sheng 等人，2017 年）。在每個（gè）時（shí）間點，每（měi）個存儲方案的（de）樣本大小為每次複製 10 個蘋果，每個存儲方案有四（sì）個獨立的複製。

居民微生物群計數

未接種蘋果的處理方式與接種蘋（píng）果相同。將適當稀釋度的摩擦溶液（yè）分別鋪在重複的（de） TSAYE 板和馬（mǎ）鈴薯葡（pú）萄糖瓊脂 (PDA; BD) 板上，用於 TPC 和酵母（mǔ）/黴菌計數。TSAYE 板在 37°C 下孵育（yù） 24 小時，而 PDA 板在室溫 (22°C) 下孵（fū）育 5 天。在每個時間（jiān）點，每個存儲方案的樣本大小（xiǎo）為每次複製 10 個蘋果，每個存儲方案有四個獨立的複（fù）製。

水果品質分析

根據已發表的方法，在收（shōu）獲時以及冷藏後 6 個月和 9 個月時對未接（jiē）種（zhǒng）蘋果（guǒ）的果實質量屬性（包（bāo）括硬度、總可溶性（xìng）固形（xíng）物（wù） (TSS) 和可滴定酸度 (TA) 進行了評估（Sheng 等人，2018 年）。簡而言之，使（shǐ）用水果質地分析儀（FTA GS-15-643，Güss Manufacturing，Ltd.，Strand，南非）在去皮區域（~3 cm 2) 在每個蘋果的陽光照射和陰影麵。TSS 含量使用（yòng） Atago PR-32 數（shù）字糖度折光儀（Atago Co., Ltd., Tokyo, Japan）測量。果汁的（de） TA 表示為蘋果酸含量的（de）百分比（每 100 克蘋果鮮重的蘋果酸克數），並使用電位滴定儀（Titrando 888 和 875 Robotic USB Sample Processor XL, Metrohm, Riverview, FL, United狀態）。蘋果質量分析（xī）使用（yòng）了每次重複 10 個蘋果的樣（yàng）本量（liàng），每個存（cún）儲方案（àn）有四（sì）個獨（dú）立的重複。

水果（guǒ）障礙分析（xī）

在收獲時（shí）和（hé）冷藏 6 個月和 9 個月後檢查水果是否有外部疾病。外部疾病包括臭氧燒傷（蘋果暴露側的表麵凹（āo）坑）、表麵燙傷（皮膚上的（de）棕（zōng）色斑塊和變色）、皮孔腐爛（làn）（皮孔周圍的深棕色凹坑（kēng））、腐（fǔ）爛（可見的菌絲體或孢子團）、赤（chì）褐色（在皮（pí）膚）和 CO 2損傷（皮膚上的雪（xuě）花樣（yàng）斑塊）按照先前描述的標準標準進（jìn）行目視檢查（Sheng 等人，2018 年）。軟燙傷，特征是蘋果表麵有（yǒu）光滑或不規則形狀的棕色損傷（DeEll，2013)，也進行了評估。蘋果被（bèi）切（qiē）片 3 次，用於評估內部疾病，包（bāo）括水核和內部褐變。Watercore 的特點是富含山梨糖醇的液體在與脈管係（xì）統相鄰的肉的細胞間隙中積聚（Marlow 和 Loescher，1984 年）。內部褐變的特征是通常起源於（yú）核心區（qū）域附近的果肉變褐色（Argenta 等，2001）。結果報告為每個貯藏期內單獨處理中的蘋（píng）果與（yǔ）各自的無序/總蘋（píng）果 (%)。內部紊（wěn）亂評估使用每個重複（fù） 10 個（gè）蘋果的樣本大小，每（měi）個儲存方案有四個（gè）獨（dú）立重（chóng）複。對於外部紊（wěn）亂評估（gū），每個存儲方案使用 100 個蘋果的樣本大小。在室溫 (22°C) 下 1 天和 7 天後對蘋果進行評估。

統計分析

使用 IBM SPSS 19.0 (Chicago, IL, United States) 分析數據。通（tōng）過單向方差分析 (ANOVA) 識別平均差異，然後進行 Tukey 多重比較測試。p < 0.05 的值被認為具有統計學意義。

圖所示。紅鮮蘋（píng）果商業冷藏36周內無（wú）毒蜱的存活（huó）研究（jiū）。a - cMean在（zài）沒有公共字母的各采樣點上差異顯著(p < 0.05)。平均值±SEM, n = 32-40。MCP，蘋（píng）果在冷藏前用1-MCP處理;CAHighO3, CA儲存，氣體（tǐ）O3持續施加在78.7±13.2 μg/L;CAMCPHighO3, CA儲存時連（lián）續施加（jiā）氣體O3(78.7±13.2 μg/L)，冷（lěng）藏前用1-MCP處理蘋果;CAMCPLowO3, CA儲存時連續施加氣體（tǐ）O3(60.2±5.7 μg/L)，蘋果在冷藏前用1-MCP處理。

圖在商業冷藏的36周內，紅美味蘋果上的（de）駐留細菌。a,b不帶公（gōng）共（gòng）字母的各（gè）采樣點均值（zhí）差異顯著(p < 0.05)。均值±SEM, n = 40。MCP，蘋果在冷藏前用1-MCP處理;CAHighO3, CA儲存，氣體O3持續施加在78.7±13.2 μg/L;CAMCPHighO3, CA儲存時連續施加氣體O3(78.7±13.2 μg/L)，冷藏前用1-MCP處理蘋果;CAMCPLowO3, CA儲存時連（lián）續施加氣體O3(60.2±5.7 μg/L)，蘋果在冷藏（cáng）前用1-MCP處理。

結（jié）論

經過（guò） 9 個月的商業 RA 或 CA 儲存，Red Delicious 蘋果上的無害乳杆菌計數減少了 ~2 log CFU/蘋果。在60.2–78.7 μg/L 的連（lián）續低劑量臭氧氣體處理下，無害乳杆菌的減少量增加了（le） 1,000 倍；> 5.0 log 10 CFU/蘋果在儲存 24 周後減（jiǎn）少（shǎo）。此外，與（yǔ）無臭氧氣體的 CA 儲存相比，在 CA 儲（chǔ）存（cún）中應用低劑量氣態臭氧可延緩常駐微生物群的生長，延緩蘋果（guǒ）硬度損失，改善蘋果品質，並且對 Red Delicious 蘋果的外部疾病沒有負麵影響。因此，低劑量的連續氣態臭氧應用是蘋果行業控製李斯特菌的一個有前景的策略。和 Red Delicious 蘋（píng）果上的（de）微生物腐爛。需要（yào）進一步研究不同臭氧用量（liàng）和蘋果品種，以確保新（xīn）鮮蘋果（guǒ）的安全和質（zhì）量。